چشم انسان قدرت دارد اشیاء ریز تا حد ذره غبار ۲۰ میکرومتری را در زیر درخشش پرتوی از نورآفتاب ببیند اما توانایی دیدن میکروارگانیسم های کوچک در حد باکتری را که بین ۰/۵ تا ۲ نانومتر قطرشان است را بدون داشتن تجهیزات ریزبینی ندارد.
از طرفی دیدن این موجودات برای بشر بسیار پر اهمیت است. اهمیت این موجودات به حدی است که می توان گفت بدون آنها جهان اطراف ما و حتی خود ما وجود نداشتیم! بشر امروز برای پی بردن به اسرار دنیای شگفت انگیز این موجودات بسیار ریز از فن آوری ریزبینی استفاده می نماید. ریزبینی (Microscopy) فن آوری قابل دید ساختن اشیاء بسیار کوچک توسط چشم انسان است. هدف از این آزمایش آشنایی با اصول ریز بینی و به کارگیری تجهیزات ریزبینی مثل میکروسکوپ ها و تکنیک هایی است که مشاهده و تشخیص این موجودات را با تجهیزات ریزبینی آسان می کند.

همه ما به خوبی می دانیم که برای دیدن هر شیئی احتیاج به نور است. چه بخواهیم آن را به صورت مستقیم ببینیم چه از داخل آینه و یا از پشت یک عدسی.اما اینکه چه نوری و با چه ویژگی هایی استفاده کنیم در توانایی ما برای دیدن اشیاء تاثیر می گذارد.
تصور کنید می خواهیم شیئی شبیه به حرف E را که در جلوی یک پس زمینه سفید آویخته است بوسیله توپ هایی جوهر اندود با قطرهای مختلف که به طرف آن پرتاب می شوند مشاهده کنیم. توپ هایی که به طرف شیء پرتاب می شوند در این مثال به نور تشبیه شده و قطر این توپ ها به طول موج آن. در صورتی که قطر توپ ها از فاصله بین دوبازوی حرف E بیشتر باشد بازوها قابل تمایز نخواهد بود. مثلا اگر توپ بسکتبال به طرف آن پرتاب کنیم اصلا حرف E مشخص نمی شود. اگر توپ تنیس پرتاب کنیم وضوح تصویر بهتر می شود و درصورتی که اندازه گلوله هایی که به طرف شیء پرتاب کنیم بازهم ریزتر باشد وضوح تصویر بیشتر و بیشتر می شود.
حال تصور کنید در حال دیدن شیئی با همین شکل ولی با اندازه ای در حد طول موج خود نور هستیم! اینجاست که ویژگی هایی مثل طول موج نور و تفکیک پذیری بسیار اهمیت پیدا می کند. در این حالت اگر طول موج نوری که به طرف شیء پرتاب می شود از فاصله بازوهای حرف E بیشتر باشد شیء را مات و هرچه این طول موج کوتاه تر باشد شیء را واضح تر می بینیم. در مثال فوق به دو ویژگی مهم نور اشاره شد که بجاست به صورت دقیق تری تعریف شوند:

طول موج: برابر است با فاصله بین دو فراز یا دو فرود موج
تفکیک پذیری: قابلیت دیدن دو شیء به صورت دو واحد مجزا از هم

رابطه این دو ویژگی به این صورت است که: هرچه طول موج کوتاه تر باشد، تفکیک پذیری بیشتر می شود اما همانطور که اشاره شد دیدن اشیاء خیلی کوچک در حد باکتری احتیاج به تجهیزات ریزبینی دارد. هرچه شیء مورد نظر کوچکتر باشد برای مشاده آن باید از پرتوهای کوچکتری استفاده شود و برای این کار نیاز به تجهیزاتی است که از پرتوهای کوچکتری استفاده می کنند.مثلا میکروسکوپی که با نور فرابنفش کار می کند بهتر از میکروسکوپی که با نور مرئی کار می کند اجزاء درون سلول را مشخص می سازد. یا مثلا برای دیدن ذراتی به کوچکی یک ملکول یا اتم دیگر از پرتوهای نوری کاری ساخته نیست و باید به پرتوهای الکترونی روی آورد. با پیدایش میکروسکوپ های الکترونی که از پرتوهای الکترونی به جای پرتوی نور استفاده می کنند توانایی بشر برای دیدن اشیاء خیلی ریز با تفکیک پذیری بالا خیلی بیشتر شد. بطوری که امروزه با میکروسکوپ های الکترونی خیلی پیشرفته (مثل AFM) ملکولها و حتی اتمهای منفرد را هم می توان دید. از آنجا که در این آزمایش هدف ما مشاهده باکتریها می باشد و این کار با میکروسکوپ های نوری به راحتی قابل انجام است شناسایی دقیق اجزاء این میکروسکوپ برای ما خیلی مهم است.

اصول ریزبینی

1- ویژگی های نور: طول موج و تفکیک پذیری
2- آشنایی با قسمتهای مختلف میکروسکوپ نوری
3- تکنیکهای ریزبینی نوری

3-1 آماده سازی نمونه 3-2 اصول رنگ آمیزی

1- ویژگی های نور: طول موج و تفکیک پذیری

نور ویژگی هایی دارد که که روی توانایی ما در دیدن اشیاء، چه با چشم غیرمسلح و چه با میکروسکوپ اثر می گذارد. یکی از مهمترین ویژگی های نور طول موج است. طول موج نور مورد استفاده برای مشاهده بستگی زیادی به تفکیک پذیری قابل دستیابی دارد. تفکیک پذیری به قابلیت دیدن دو شیء به صورت دو واحد مجزا از هم برمی گردد. برای اینکه دو شیء بتوانند به صورت دو واحد مجزا از هم دیده شوند باید نور بتواند از بین آنها عبور کند. اگر طول موج نوری که با آن این دو تصویر را مشاهده می کنیم آنقدر بزرگ باشد که نور نتواند از بین آن دو عبور کند آن دو شیء یکی دیده می شوند. برای درک بهتر این پدیده، شیئی شبیه به حرف E که در جلوی یک پس زمینه سفید آویخته است در نظر بگیرید که توپ هایی جوهر اندود با قطرهای مختلف به طرف آن پرتاب می شوند. در صورتی که قطر توپ ها از فاصله بین دوبازوی حرف E بیشتر باشد بازوها قابل تمایز نخواهد بود. مثلا اگر توپ بسکتبال به طرف آن پرتاب کنیم اصلا حرف E مشخص نمی شود. اگر توپ تنیس پرتاب کنیم تفکیک پذیری بهتر می شود و درصورتی که گلوله های ریزتر به طرف آن پرتاب کنیم بازهم وضوح تصویر بیشتر می شود. شکل1- تشبیه طول موج نور به قطر توپ قطر توپ ها در مثال فوق به طول موج نور تشبیه شده است. هرچه طول موج نور مورد استفاده در میکروسکوپ کمتر باشد وضوح تصویر بیشتر می شود و جزئیات بیشتری را نشان می دهد. مثلا میکروسکوپ هایی که با نور مرئی فرابنفش کار می کنند بهتر از میکروسکوپی که با نور مرئی کار می کند اجزاء درون سلول را مشخص می سازد. با پیدایش میکروسکوپ های الکترونی که از الکترون به جای پرتوی نور استفاده می کنند توانایی بشر برای تفکیک پذیری اشیاء خیلی بیشتر شد. بطوری که امروزه با میکروسکوپ های الکترونی خیلی پیشرفته (مثل AFM) ملکولها و حتی اتمهای منفرد را هم می توان دید.

2- آشنایی با قسمتهای مختلف میکروسکوپ نوری

میکروسکوپ های نوری یا اپتیکی از زمان لیوونهوک (Leeuwenhoek) تا کنون دستخوش اصلاحات زیادی شده اند. شکل امروزی میکروسکوپ نوری که شامل بیش از یک لنز می باشد میکروسکوپ نوری ترکیبی نام دارد. شکل 2 اجزاء مختلف این میکروسکوپ را نشان می دهد.

قسمتهای مهم یک میکروسکوپ نوری ترکیبی عبارتند از:

1- پایه:(Base) ساختار نگهدارنده که معمولا منبع نوری قسمتی از آن می باشد.
2- کندانسور:(Condenser) پرتوهای نور را جمع نموده و از داخل نمونه عبور می دهد
3- دیافراگم (Iris diaphragm): مقدار نور عبوری از داخل نمونه را کنترل می کند.
4- لنز شیئی (Objective lens): تصویر را بزرگ می کند.
5- لنز چشمی (Ocular lens): تصویر دریافتی از عدسی شیئی را بزرگ می کند.
6- سکوی مکانیکی(Mechanical stage): کنترل دقیق حرکت اسلاید (لام)
7- تنظیم درشت(Coarse adjustment): توپی مکان یابی نمونه
8- تنظیم ریز(Fine adjustment): توپی مورد استفاده برای تمرکز دقیق بر روی نمونه

3- تکنیک های ریزبینی نوری

میکروسکوپ ها کاربرد محدودی دارند مگر اینکه نمونه ها قبل از مشاهده به خوبی آماده سازی گردند. در این آزمایش تعدادی از تکنیک های مورد استفاده برای آماده سازی نمونه ها برای ریزبینی نوری انجام گردید.

3-1 آماده سازی نمونه

روش Wet mount
برای مشاهده میکروارگانیزم ها به صورت زنده از این روش استفاده می گردد. قطره ای از محیط حاوی ارگانیسم های مورد نظر بر روی لام میکروسکوپ قرار داده و روی آن یک پوشش شفاف (Coverslip) گذاشته می شود. در این حالت با استفاده از میکروسکوپ، ارگانیسم ها را به گونه ای که گویا در استخری کم درحال شناکردن می باشند مشاهده می کنیم. در موقع گذاشتن پوشش باید دقت کنیم حباب هوا در زیر پوشش به دام نیفتد. در این تجربه عملی دسته ای باکتری از گونه E.coli در زیر میکروسکوپ با این روش مشاهده شدند. این باکتری در حالت عادی استوانه ای شکل است اما مشاهده آنها از بالا باعث می شود تعدادی از آنها که در حالت ایستاده قرار دارند به شکل دایره ای دیده شوند.
روش لکه (Smear)
برای مشاهده میکروارگانیسم ها به صورت بی جان و غیرمتحرک از این روش استفاده می شود. البته این ها هنگامی که روی لام قرار می گیرند زنده هستند اما برای تثبیت (یا چسباندن) آنها به لام تکنیک هایی استفاده می شود که باعث کشته شدنشان می شود. تهیه لکه اغلب برای مبتدی ها کار دشواری است. اگر لکه بیش از حد ضخیم تهیه شود دیدن میکروارگانیسم ها به صورت منفرد مشکل است و اگر هم بیش از حد نازک تهیه شود اصلا میکروارگانیسمی دیده نمی شود. اگر موقع پخش بر روی لام قطره محیط کشت را بیش از حد به هم زده شود آرایش سلولی از هم گسیخته می شود. ممکن است سلولهایی که مثلا در حالت عادی به صورت گروه های چهارتایی در کنارهم (تتراد) دیده می شوند به صورت دوتایی یا تکی دیده شوند. بعد از تشکیل لکه به آن اجازه داده میشود تا به طور کامل در هوا خشک شود. سپس برای سه تا چهار مرتبه به سرعت از روی شعله باز عبور داده می شود. به این فرایند تثبیت حرارتی (Heat fixation) گفته می شود. تثبیت حرارتی سه کار را انجام می دهد: 1) میکروارگانیسمها را می کشد. 2) باعث می شود ارگانیسم به لام بچسبد 3) ماهیت ارگانیسزم ها را عوض می کند به طوری که سریعتر رنگ را بپذیرد. اگر لام موقعی که از داخل شعله عبور داده می شود کاملا خشک نشده باشد ارگانیسم ها به جوش آمده و از بین می روند. اگر زمان تثبیت حرارتی شما کوتاه باشد ممکن است ارگانیسم ها خوب به لام نچسبیده و در مراحل بعدی از روی سطح لام شسته شوند. اگر زمان تثبیت حرارتی شما بلند باشد ارگانیسم ها ممکن است بسوزند. در این حالت چیزی که مشاهده می کنید سلول های واپیچیده و بقایای سلولی هستند. کپسول سلول با تثبیت حرارتی از بین می روند.

3-2 اصول رنگ آمیزی

رنگ، ملکولی است که می تواند به ساختارهای سلولی چسبیده و آن را رنگی کند. تکنیکهای رنگ آمیزی باعث می شوند سلول نسبت به زمینه خود برجسته و متمایز شود. با استفاده از این تکنیک ها می توان ارگانیسم ها را گروه بندی نمود. بررسی تفاوت های شیمیایی و ساختاری آنها و همچنین مشاهده بخشهای مختلف سلول با این تکنیک ها قابل انجام است. رنگ آمیزی گرم رنگ گرم که احتمالا متداولترین رنگ افتراقی مورد استفاده در میکروبیولوژی است توسط یک پزشک دانمارکی به نام هانس کریستین گرم در سال 1884 ابداع شد. در این روش سلولهای باکتری رنگ کریستال ویوله را جذب می کنند. سپس ید به عنوان ماده ثابت کننده رنگ (mordant) اضافه می شود. ماده ای شیمیایی که رنگ را در سلول های مشخصی نگه می دارد. ساختارهایی که نمی توانند کریستال ویوله را نگه دارند توسط الکل 95درصد یا محلول اتانول- استن رنگبری ، آبکشی و متعاقبا با سافرانین (Safranin) رنگ آمیزی مجدد می گردند.

مراحل رنگ آمیزی گرم به شرح زیر می باشد:

1- روی لکه تثبیت شده محلول کریستال ویوله ریخته برای مدت یک دقیقه به حال خود رها نموده و پس از یک دقیقه با آب مقطر شستشو داده می شود. در این مرحله همه ارگانیسم ها چه گرم مثبت و چه گرم منفی به رنگ بنفش هستند. ارگانیسمهای آزمایش شده باکتری گرم مثبت کوکسی شکل به نام استافیلوکوکوس و باکتری گرم منفی E.coli بودند.
2- روی لکه شسته شده مرحله قبل لوگول (محلول ید) ریخته و برای مدت یک دقیقه زمان می دهیم. ید به عنوان ثابت کننده رنگ عمل می کند.
3- با الکل شستشوی سریع داده و بلافاصله بعد با آب شستشو داده می شود. در این مرحله باکتری های گرم مثبت به رنگ بنفش و باکتری های گرم منفی بی رنگ می شوند.
4- شستشو با سافرانین به مدت 30 تا 60 ثانیه. در این مرحله باکتری های گرم مثبت، بنفش و باکتری های گرم منفی، قرمز رنگ می گردد.

مواد مورد نیاز
- محلول رنگ کریستال ویوله
- لوگول (محلول ید)
- رنگ سافرانین
- اتانول 95درصد
- نمونه باکتری های کشت شده

وسایل و تجهیزات
- لوپ
- میکروسکوپ نوری
- لام (Slide)
- پوشش شفاف روی لام (Coverslip)
- روغن ایمرسیون
- چراغ بونزن (شعله باز)

میکروارگانیسم های مورد آزمایش باکتری گرم منفیE.coli و باکتری گرم مثبت Staffبود.

نتیجه:

نتیجه آزمایش گرم بر روی هر دو ارگانیسم آزمایش شده گرم منفی بود.

•
•

مطلب فوق را در شبکه های اجتماعی زیر با دوستانتان به اشتراک بگذارید